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    藍景科信DAP-SEQ(DNA親和純化測序)技術服務常見問題

    發布時間:2021-03-22   點擊次數:1044次

    DAP-SEQ技術簡介
    DAP-SEQ是基于DNA親和純化,通過體外表達轉錄因子鑒定TFBS的技術,具有不受抗體和物種限制,且高通量的優勢,自該技術問世以來,已被廣泛應用于轉錄調控和表觀組學的研究。

    那么關于DAP-SEQ都有哪些問題需要關注呢?

    1. DAP-seq原理、技術流程,能解決什么樣的問題?
    原理:體外表達的蛋白和DNA進行親和純化,將與蛋白結合的DNA洗脫后進行高通量測序。
    技術流程:將編碼轉錄因子的CDS序列構建到含有親和標簽的載體中,構建蛋白表達載體,進行體外蛋白表達,形成轉錄因子和親和標簽的融合蛋白;提取樣品的基因組DNA,構建DNA文庫,然后將體外表達的帶有親和標簽的轉錄因子和DNA文庫進行結合,隨后把結合的DNA洗脫后上機測序。
    能幫助您快速找到轉錄因子的結合位點,尋找轉錄因子調控的靶基因。

    服務流程:

    DAP-SEQ實驗流程
     

    2. 需要提供什么材料?
    需要您提供:
    (1)組織材料或者是提取好的基因組DNA;
    (2)含有轉錄因子CDS序列的質粒。

    3. 分析結果包括哪些內容?
    藍景科信DAP-seq的生信分析包括以下內容:
    1.對原始數據進行去除接頭、污染序列及低質量 reads 的處理
    2.數據產出統計
    3.參考序列比對分析
    4.測序reads富集區域掃描(peak calling)
    5.Peak長度分布統計
    6.Peak在基因功能元件上的分布統計
    7.Peak序列模式發掘(motif search)
    8.已知motif注釋
    9.Peak相關基因鑒定
    10.Peak相關基因的GO和KEGG富集分析
    11.測序數據的差異分析(>=2個樣本)
    12.測序數據的可視化分析

    4.實驗的成功率怎么樣?
    不同轉錄因子家族的成功率不同,請參考不同轉錄因子家族的DAP-seq成功率:

    在這里插入圖片描述
    5. 為什么有些基因家族的成功率很低?
    有些轉錄因子需要和其他蛋白形成復合體才能與DNA結合,這些蛋白的風險比較高。

    6. 一些特殊的樣品能不能做,有沒有風險?
    有兩種情況的樣品是不能做DAP-seq 實驗的,一種情況是沒有參考基因組,另一種情況是轉錄因子不能在體外表達出來,除此之外,我們會做可行性分析報告供您參考。

    7. 包含重復嗎?
    包含兩個技術重復。

    8. 做這個蛋白表達的時候,使用的什么表達系統?
    優先使用真核表達系統進行蛋白表達,如果真核表達系統不能表達成功的話可以溝通換用原核表達系統。

    9. 植物組織樣本取樣的時期部位有什么要求?
    植物組織樣本取樣的時期和部位是您根據自己的研究需求確定,不同組織和時期DNA的修飾不同,可能會影響蛋白和DNA的結合。

    10. DAP-seq跟ChIP-seq有何區別,DAP-seq的優勢表現在哪里?
    DAP-seq和ChIP-seq的區別:

    在這里插入圖片描述

    DAP-seq的優勢:不需要針對每個轉錄因子制備特異性抗體,快速、高通量、節約時間成本。

    11. DAP-seq用的input是什么,為什么選這個作為對照呢?
    Input對照是用的親和純化前的文庫,目的是降低背景噪音,我們用的Input和2016年發表在Cell(DAP Seq-Cistrome and Epicistrome Features Shape the Regulatory DNA Landscape)上的論文是一致的。

    12. 為什么實驗中表達的有些蛋白比理論值偏大?
    很多蛋白表達出來比理論值大一些,因為有一些翻譯后修飾,很多情況都是這樣的,原核表達也有這類情況,比如擬南芥SnRK蛋白激酶,預測40 kd,通過原核表達,實際分子量是60 kd。

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